Chemoproteomics и ABPP: идентификация ковалентных мишеней лекарств in situ

Ковалентные ингибиторы переживают ренессанс — осирулиниб, занубрутиниб, сотораcиб и их аналоги изменили онкологию. Но как найти следующую мишень? Chemoproteomics и ABPP дают ответ прямо в живых клетках, без предположений о структуре белка.

Что такое ABPP и чем он отличается от обычной протеомики

Activity-Based Protein Profiling (ABPP) использует химические зонды — «warhead + reporter tag» — для ковалентного мечения активных форм ферментов in situ. В отличие от обычной протеомики, ABPP измеряет не количество белка, а его функциональную активность в нативном клеточном контексте. Это принципиально важно: 80% протеом нельзя охватить антителами, а фолдинг и посттрансляционные модификации меняют реакционноспособность.

Типичный ABPP-зонд: иодоацетамид-алкин (IAA-alkyne) или акрилатный зонд (IA-rhodamine) ковалентно метит цистеиновые остатки, азидо-группа или алкин участвует в CuAAC «click»-реакции с биотином или флуорофором для обогащения и идентификации. Результат — список «ковалентно-доступных» цистеинов с точностью до аминокислоты.

Протокол isoTOP-ABPP для оценки лигандируемости в 2026 году

Современный isoTOP-ABPP (isotopic Tandem Orthogonal Proteolysis ABPP) включает:

1. Живые клетки инкубируют с тестируемым соединением (10–100 мкМ, 1 ч, 37°C), затем с IAA-alkyne зондом (100 мкМ, 1 ч).
2. Click-реакция: TBTA/CuSO₄/аскорбат, биотин-азид.
3. Аффинная очистка на стрептавидиновых шариках, трипсиновый дайджест.
4. Изотопное мечение: SILAC или TMT для сравнения обработанных и контрольных клеток.
5. LC-MS/MS: идентификация цистеинов со сниженным ABPP-сигналом (R = конкурентное связывание соединения).

Чувствительность современных оРТОF-масс-спектрометров (Thermo Astral, 2025) позволяет идентифицировать >10 000 уникальных цистеинов за один эксперимент против 5 000–6 000 у предыдущих платформ.

Selectivity profiling: как найти off-targets заранее

Обратная задача ABPP — проверка селективности перед клиническим применением. Соединение-кандидат конкурирует с IAA-alkyne: чем сильнее конкурентное ингибирование ABPP-сигнала для данного цистеина — тем выше аффинность. «R-ratio» < 0.1 при 1 мкМ указывает на ковалентное связывание с IC₅₀ ниже 10 нМ.

В 2026 году компания Pfizer опубликовала данные селективности нового KRAS G12C-ингибитора (структурный аналог AMG-510 с улучшенной фармакокинетикой): из 2,114 протестированных реакционноспособных цистеинов значимое конкурентное связывание (R < 0.2) выявлено только у KRAS C12 и трёх off-target цистеинов, два из которых не влияют на выживаемость клеток.

Fragment-based ABPP: поиск мишеней с нуля

Комбинация ABPP с фрагментными библиотеками (fragment-based covalent drug discovery) — наиболее перспективный подход 2026 года. Библиотека из 500–3000 акриламидных или хлорацетамидных фрагментов тестируется в пулах (10–20 соединений за раз). Идентифицированные «горячие точки» — цистеины, к которым сразу несколько фрагментов имеют аффинность — становятся мишенями для медхим-оптимизации. Среднее число подтверждённых ковалентных мишеней в типичном проекте: 3–7 на 1000 фрагментов.

Применения в drug discovery: от target ID до кандидата

ABPP изменил процесс: вместо целенаправленного поиска под конкретную мишень сначала картируются все «лигандируемые» цистеины протеома, а потом подбирается биологически значимая мишень из этого списка. Это открыло новые мишени: OTUD4 (деубиквитиназа), PRDX1 (пероксиредоксин), PCNA C162 — все ковалентно лигандированы и ранее не рассматривались как «druggable».

Для ABPP-экспериментов критически важна чистота реагентов. Работайте с высокочистыми белковыми реагентами и линкерными строительными блоками для синтеза ковалентных зондов.

Запросить реагенты для chemoproteomics → contacts.html